线粒体和脂滴双荧光检测试剂盒

产品货号：

YTB1063

中文名称：

线粒体和脂滴双荧光检测试剂盒

英文名称：

Mitochondria and Lipid Droplets Assay Kit with Mito-LipDrop Tracker

产品规格：

1000T|5000T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

本制品是一种基于新型荧光探针Mito-LipDrop Tracker，能同时染色检测活细胞或固定细胞内线粒体和脂滴并呈现红色和蓝色双荧光的试剂盒。本试剂盒染色后，线粒体呈现红色荧光，脂滴呈现蓝色荧光。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。

本试剂盒所使用的荧光探针Mito-LipDrop Tracker是一种具备“非反应型单分子”特性的荧光探针，可实现对脂滴与线粒体的同步靶向及双色荧光成像。其靶向机制源于其分子结构的双重优势：一方面通过亲脂性基团与高度疏水的脂滴特异性结合，另一方面凭借其带有的阳离子结构靶向具有负膜电位的线粒体。该探针无需依赖活细胞内化学反应，即可在脂滴中特异性呈现蓝色荧光，在线粒体中特异性呈现红色荧光，这一特性从根本上避免了反应过程对细胞器内环境稳态及动态相互作用的干扰，确保成像结果更贴近细胞内的真实状态。此外，Mito-LipDrop Tracker具有良好的光稳定性和适宜的荧光光谱，且荧光背景较低，应用场景广泛，不仅可用于活细胞水平的实时观测，还能用于线虫等模式生物的体内成像研究。

本试剂盒提供的Mito-LipDrop Tracker为1000×溶液，该溶液经过优化，对大多数细胞都适用，但为了得到理想的结果，对于不同类型的细胞请自行对于工作浓度进行一定摸索，Mito-LipDrop Tracker的终浓度通常为0.5～5×，最优先的推荐终浓度为1×。本试剂盒提供了Assay Buffer，该Assay Buffer可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好。使用本试剂盒检测活细胞内脂滴和线粒体的效果请参考图1B。本试剂盒还提供了诱导细胞内脂滴增多的试剂LDUp(500×)，以便于作为阳性对照观察到细胞内的脂滴。

光谱特性：

Mito-LipDrop Tracker用于细胞内脂滴检测时最大激发波长为405nm，最大发射波长为465nm；用于细胞内线粒体检测时，其最大激发波长为515nm，最大发射波长为640nm。在LDUp诱导后的NRK-52E细胞中，Mito-LipDrop Tracker标记的脂滴与线粒体的发射光光谱请参考图1A。

应用效果：

图1.本试剂盒中Mito-LipDrop Tracker标记NRK-52E细胞内脂滴与线粒体的发射光光谱以及用于检测NRK-52E细胞内脂滴与线粒体的效果图。图A为Mito-LipDrop Tracker标记的经LDUp诱导的细胞脂滴与线粒体的发射光谱。Em,Fluorescence emission。图B为Mito-LipDrop Tracker标记NRK-52E细胞内脂滴与线粒体的效果图。图a为正常NRK-52E细胞在显微镜明场下的形态，正常细胞内无明显的脂滴聚集现象，经Mito-LipDrop Tracker染色后呈较弱的蓝色荧光(图b)，主要为散在的微小脂滴染色；图e为使用LDUp (1×)诱导24小时后细胞在显微镜明场下的形态，此时细胞内有很明显的脂滴聚集，脂滴经过Mito-LipDrop Tracker染色后，呈现非常明亮的蓝色荧光(图f)。同时，正常细胞和LDUp诱导细胞的线粒体经过Mito-LipDrop Tracker染色后，均呈现非常明亮的红色荧光，线粒体结构清晰可见(图c和图g)。图d、h为脂滴和线粒体荧光染色的叠加图，LDUp诱导细胞的脂滴与线粒体呈部分共定位分布，提示二者具有一定相互作用。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

背景资料：

脂滴是由磷脂单分子层及甘油三酯、胆固醇酯组成的中性脂肪疏水核心构成，广泛存在于动物、细菌、酵母、植物和昆虫细胞中。脂滴能够沿着细胞骨架运动，并与其它细胞器相互作用，在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解、以及信号传导过程中起着重要的作用。

产品组成：

组分	1000T	5000T
Mito-LipDrop Tracker(1000×)	100μL	500μL
Assay Buffer	100mL	500mL
LDUp(500×)	50μL	250μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

规格说明：

对于96孔板中的样品，按照每孔使用100μL染色液计算，本试剂盒的两个规格分别可以进行1000次和5000次检测；如果用于流式细胞仪检测，按照每个样品的检测体系体积为0.5mL时，本试剂盒的两个规格分别可以进行200次和1000次检测；对于6孔板中的贴壁培养细胞样品，按照每孔使用1mL染色液计算，本试剂盒的两个规格分别可以进行100次和500次检测。

注意事项：

第一次使用时Mito-LipDrop Tracker(1000×)建议适当分装，避免反复冻融。
Mito-LipDrop Tracker的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等可根据所使用的细胞类型进行适当摸索和优化，例如Mito-LipDrop Tracker的浓度对于细胞染色可在0.5～5×之间适当调整，对于流式细胞仪检测可在0.1～1×之间适当调整。
为减少信号干扰并确保线粒体检测特异性，在进行线粒体荧光染色观察时应避免使用400～415nm激发波长及600nm以下发射波长的荧光显微镜配置，优先选择510～560nm激发波段与600～700nm发射波段，可有效降低荧光串色风险，提高检测的准确性与可靠性。
Mito-LipDrop Tracker在激光照射下易发生淬灭，因此需要在保证荧光亮度的前提下尽可能降低染料使用浓度，降低荧光显微镜激发光强度，缩短拍照时间。
脂滴经Mito-LipDrop Tracker染色后，其理论发射为青色荧光，但在不同显微镜的滤光片配置下，可能显示为蓝色荧光。
荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板，推荐使用黑色96孔板或黑色透明底96孔细胞培养板。
在使用多聚甲醛或甲醛等醛类固定剂固定细胞，以及使用Saponin等通透性去垢剂处理细胞时，线粒体的荧光标记不会消失，但可能会出现一定程度的信号减弱。
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

使用方法：

Mito-LipDrop Tracker染色液的配制：对于6、12、24、96孔板，每孔所需Mito-LipDrop Tracker染色液的用量分别为1mL、500μL、250μL和100μL。对于悬浮细胞样品或流式细胞仪检测，每50～100万个细胞样品需0.5mL Mito-LipDrop Tracker染色液。根据样品数量，计算所需Mito-LipDrop Tracker染色液的体积。以6孔板每孔1mL Mito-LipDrop Tracker染色液的体系为例，参考下表配制Mito-LipDrop Tracker染色液。
成分 1个样品 10个样品 100个样品
Mito-LipDrop Tracker(1000×) 1μL 10μL 100μL
Assay Buffer 999μL 9.99mL 99.9mL
Mito-LipDrop Tracker染色液 1mL 10mL 100mL
- 配制好的Mito-LipDrop Tracker染色液必须一次使用完毕，不建议冻存或4℃保存后继续使用。
- 本试剂盒中提供的Assay Buffer能够在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好；对于活细胞染色，也可以使用含血清的培养液作为Assay Buffer；对于固定细胞染色，也可使用PBS作为Assay Buffer。Assay Buffer可能会对染色结果有一定影响，可根据具体实验情况进行一定的摸索或优化。染色液中Mito-LipDrop Tracker的浓度对于细胞染色可在0.5～5×之间适当调整，对于流式细胞仪检测可在0.1～1×之间适当调整。
荧光显微镜检测：
- 接种培养：将细胞接种于6孔板等多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上。如有必要，按实验设计对细胞进行一定处理(如LDUp诱导等)。
- 固定(选做)：
  - 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤1～2次，吸除PBS。
  - 加入PFA固定液(4%)室温固定10～15分钟。
  - Mito-LipDrop Tracker适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。
  - 由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
  - 如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用含Saponin或Digitonin等不会溶解细胞膜的去垢剂的通透液，推荐免疫染色通透液(含Saponin)，但仍然可能会一定程度上影响脂滴和线粒体的形态。
- 染色：
  - 取出待检测的细胞，PBS洗涤1～2次。
  - 吸除PBS，加入适当体积的Mito-LipDrop Tracker染色液，通常96孔板每孔加入100μL，24孔板每孔加入250μL，12孔板每孔加入500μL，6孔板每孔加入1mL。37℃避光孵育30分钟。
  - PBS洗涤2次。
- 检测：Mito-LipDrop Tracker在用于检测细胞内脂滴时最大激发光波长约为405nm，最大发射光波长约为465nm；用于检测细胞内线粒体时最大激发波长约515nm，最大发射波长约为640nm。
  使用荧光显微镜拍照时，为了减少荧光淬灭，尽可能降低荧光显微镜的激发光强度，缩短拍照时间。
流式细胞仪检测：
- 细胞准备：
  - 贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤1次；悬浮细胞250～1000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤1次。每个样品推荐的细胞用量为10⁶个细胞。
  - 400×g室温离心5分钟，弃上清。
- 固定(选做)：
  - 加入PFA固定液(4%)，轻轻吹打重悬为单细胞悬液，室温固定10～15分钟。
  - 固定结束后，400×g室温离心5分钟，弃上清。
  - 加入0.5mL PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。
  - Mito-LipDrop Tracker适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。
  - 由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
  - 如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用含Saponin或Digitonin等不会溶解细胞膜的去垢剂的通透液，但仍然可能会一定程度上影响脂滴和线粒体的形态。
- 染色：
  - 对于上一步骤的细胞沉淀，除背景对照管外，其余每管加入0.5mL Mito-LipDrop Tracker染色液，轻柔并充分重悬细胞，37℃避光孵育30分钟。
  - 400×g室温离心5分钟，弃上清。
  - 每孔加入0.5mL PBS后缓慢用移液器吹打洗涤，然后400×g室温离心5分钟，弃上清。
  - 每孔加入0.5mL PBS重悬细胞。
- 检测：检测时参考Mito-LipDrop Tracker光谱特征选择合适的检测条件，例如脂滴Ex/Em=405/465nm，推荐用PB450通道(Ex/Em=405/450)进行检测。线粒体Ex/Em=515/640nm，推荐用PC5通道(Ex/Em=561/675)通道进行检测。
  - 使用仅含Assay Buffer并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。
  - 由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对Mito-LipDrop Tracker的稀释倍数进行适当优化，推荐在0.1～1×之间适当调整。
荧光酶标仪检测：
- 接种培养：将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，每孔的细胞数需要控制在100～10000个，通常宜在2000～5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。
  细胞数目可根据荧光强度进行调整。细胞也可接种于其他细胞培养板中，经胰酶消化后收集，用于后续实验。
- 固定(选做)：
  - 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤1～2次，吸除PBS。
  - 加入PFA固定液(4%)室温固定10～15分钟。
  - Mito-LipDrop Tracker适用于活细胞染色，也适用于固定后细胞的染色。
  - 由于醇类能够溶解脂质，因此请使用醛类固定液进行固定。
  - 如果需要进行免疫染色而进行细胞通透，须避免使用含Triton X-100或Tween-20等去垢剂的通透液，而使用含Saponin或Digitonin等不会溶解细胞膜的去垢剂的通透液，但仍然可能会一定程度上影响脂滴和线粒体的形态。
- 染色：
  - 取出待检测的细胞，使用PBS洗涤1～2次。
  - 吸除PBS，加入适当体积的Mito-LipDrop Tracker染色液，通常96孔板每孔加入100μL。37℃避光孵育30分钟。
  - PBS洗涤2次。
- 检测：参考Mito-LipDrop Tracker光谱特征，选取合适的波长进行读板，例如脂滴Ex/Em=405/465nm；线粒体的Ex/Em=515/640nm，波长宽度推荐5nm或者12nm，顶读。具体根据酶标仪的特点选择，也不一定需要选用最大激发光/发射光波长进行检测。
阳性对照的诱导方法：LDUp可以诱导培养细胞内脂滴生成，从而可以作为阳性对照。LDUp诱导培养细胞内形成脂滴的具体方法如下。
- LDUp (500×)使用时37℃加热溶解并混匀后即可使用。
- 细胞诱导前，配制含LDUp的完全培养液，使LDUp的终浓度为1×。
  LDUp具有一定的细胞毒性，具体因细胞而异，可以根据不同细胞状况调整LDUp的使用终浓度。
- 待检测的细胞加入含LDUp的完全培养液，37℃培养过夜。通常情况下，次日可以观察到明显的脂滴形态。

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成分	1个样品	10个样品	100个样品
Mito-LipDrop Tracker(1000×)	1μL	10μL	100μL
Assay Buffer	999μL	9.99mL	99.9mL
Mito-LipDrop Tracker染色液	1mL	10mL	100mL

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